HPLC pengertian,prinsip,definisi,jenis

1.      PENGERTIAN HPLC

            HPLC adalah metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC pelarutnya menetes melalui kolom dibawa pengaruh gravitasi, terdapat pompa yang dapat memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm.

HPLC dibagi menjadi dua yakni:

a)      Fasa normal ►jika fasa diamnya lebih polar dibandingkan dengan fasa geraknya.

b)      Fasa terbalik►jika fasa diamnya kurang nonpolar disbanding dengan fasa geraknya

2.      JENIS-JENIS HPLC

HPLC pada umumnya memiliki jenis kromatografi:

a)      Kromatografi adsorbs ►fasa diam: silica

b)      Kromatografi fase terikat ► fasa gerak: hodrokarbon-hidrokarbon nonpolar seperti oktadesilsilana, oktasilana, dan fenil. Dan fasa diamnya : oktadesilsilan ODS/C18)

c)      Kromatografi penukar ion ► fasa diam : resin

Digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan pelarut organik. Fasa Gerak : air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam.

d)     Kromatografi pasangan ion

e)      Kromatografi eklusi ukuran ► untuk menganalisis senyawa dengan berat molekul ≥ 2000 dalton. Fasa diam : silica/polimer

f)       Kromatografi afinitas ► fasa diam : mengandung gugus-gugus molekul yang dapat menyerap sampel terkait muatan/sterik

3.      PRINSIP KERJA HPLC

Adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya alatnya terdiri dari kolom sebagai Fasa Diam dan larutan tertentu sebagai Fasa Gerak.

Prinsip kerja  HPLC ialah dengan bantuan pompa fase gerak cair dialirkan melalui kolom menuju detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikkan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara  solute-solut terhadap fase diam.

Solut-solut yang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebalikya, solute-solut yang kuat berinteraksinya dengan fase diam maka solute tersebut akan keluar kolom, dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja system HPLC dan mengumpulkan serta mengolah hasil data pengukuran HPLC.

Urutan skala kepolaran:

Golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi <golongan eter< golongan ester < golongan keton < golongan alcohol < golongan asam

4.      JENIS HPLC BERDASARKAN KEPOLARAN FASA DIAM DAN FASA GERAK

a.       HPLC Fasa Normal

► fasa diamnya polar dan fasa geraknya nonpolar. Fasa diam : silica. Fasa gerak : heksana atau I – propileter

b.      HPLC Fasa Terbalik

► fasa diamnya nonpolar dan fasa geraknya polar. Fasa gerak : air, methanol atau asetonitril

Fasa diam yang paling banyak digunakan adalah Oktadesilsilan (ODS atau C18). Fasa gerak adalah campuran methanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan Buffer. Peranan pH untuk solute sangat penting karena kalau pH fasa gerak tidak diatur maka solute akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya ionisasi menyebabkan melemahnyaikatan fasa diam karena yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

5.      INSTRUMENT HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

a.       Wadah fasa gerak ( Reservoir )

Keadaan wadah fasa gerak harus bersih dan lembam ( inert ). Wadah fasa gerak ini biasanya dapat menampung 1 hingga 2 liter pelarut. Fasa gerak yang akan digunakan harus dideggasing ( penghilangan gas ) yang ada pada fasa gerak. Karena dengan adanya gas pada fasa gerak akan menyebabkan detektor terganggu maka akkan mengacaukan hasil analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fasa gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fasa gerak berubah ubah selama elusi).

b.      Pompa

Pompa yang digunakan sama halnya seperti wadah fasa gerak yaitu harus inert terhadap fasa gerak. Biasanya bahan yang digunakan untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Tekanan dari pompa sebaiknya bertekanan  5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan dari pompa ini agar fasa gerak dapat berlangsung secara tepat, konstan, dan bebas dari gangguan.  Ada dua jenis pompa dalam HPLC :

1.      Pompa dengan tekanan konstan

2.      Pompa dengan aliran fasa gerak yang konstan

c.       Tempat Injeksi

Sampel yang akan dimasukan dalam kolom akan diinjeksi melalui injektor.Volume sampel yang diinjeksi 20-500µL. Ada tiga tipe injector yaitu stop-flow,septum,Loop Valve.Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. 

           

Posisi pada saat memuat sampel                 Posisi pada saat menyuntik sampel

Syarat-syarat injektor yang baik:

1.      Dapat memasukan sampel kedalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin

2.      Mudah digunakan

3.      Keberulangan tinggi

4.      Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

d.      Kolom

Kolom merupakan tempat dimana fasa diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solute.

Kolom adalah tabung yang dikalibrasi lurus ang panjangnya antara 3 dan 15 cm dan pada dinding b glan dalam kadang-kadang dilapisi dengan material inert seperti kaca atau PEEKÂ @. Kolom bisa terbuat dari sejenis plastik disebut cartridge, atau terbuat dari stainless steel.

Stainless Steel

Kolom pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) merupakan bagian yang sangat penting, sebab pernisahan komponen-komponen sampel akan terjadi di dalam kolom.

Kolom dapat dibedakan menjadi dua:

1. kolom analitik : Diameter dalam 2-6 mm.Panjang kolom tergantung pada jenis
material pengisi kolom.

2. Kolom preparative : Umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25-100 cm.

    Jenis kolom berdasarkan ukuran :

Jenis-jenis kolom HPLC

Jenis kolom	Panjang (cm)	Diameter (mm)	dp (gm)
Konvensional	10 -20	4,5	10
Microbore	10	2,4	5
High Speed	6	4,6	3

Pemilihan Kolom 

• Ada beberapa cara yang dapat digunakan yaitu .

1.        Tetapkan Tujuan Pernisahan Anda. Tentukan apakah aplikasi Anda membutuhkan resolusi tinggi, waktu analisis singkat,maksimum sensitivitas, waktu hidup kolom yang panjang, biaya operasi yang rendah, atau faktor penting lainnya.

2.        Menyamakan kolom yang digunakan untuk analit lain yang serupa

3.        Mendapatkan informasi dari pustaka

Mekanisme Kerja di Dalam Kolom 

Didalam kolom terjadi pemisahan kompenenkomponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu, sebaliknya solutsolut yang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama

Penggunaan Kolom

Banyak faktor harus diperhatikan di menggunakan kolom, agar kolom dapat berfungsi dengan baik dalam waktu yang relatif panjang. Faktor-faktor yang harus diperhatikan tersebut seperti:

1. Kualitas Pelarut

2. Larutan Pencuci Kolom

3. Pelarut untuk menyimpan kolom

4. Penggunaan pre coloum

Hal-hal Iain yang perlu diperhatikan yaitu pengeluaran gas ('de-gas') dengan menarik gelembung udara dari dalam media dengan menggunakan peralatan pompa vakum.

 Pelarut untuk menyimpan kolom

Umumnya jenis pelarut yang digunakan untuk menyimapan kolom harus disesuaikan dengan jenis kolomnya. Sebagai contoh :

1.      Kolom penukar ion disimpan dalam metanol atau air. Metanol lebih disukai karena dapat mencegah pertumbuhan bakteri.

2.      Kolom fasa terikat tak polar disimpan dalam metanol. Asetonitril tidak dianjurkan untuk dipakai di sini karena selain harganya mahal, asetonitril ini dapat terurai membentuk pengotor pada kolom.

3.      Kolom fasa terikat polar disimpan dalam heptana atau metanol.

4.      Kolom silika disimpan dalam heptana.

Di dalam penyimpanannya jangan sekali-kali kolom dibiarkan kering. Pada kolom yang kering dapat terjadi kekosongan karena paking kolom dapat mengkerut dari dinding kolom atau karena pengerutan paking kolom itu sendiri.

e.       Detektor

Suatu detector dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel didalam kolom ( analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif).

Karakteristik Detektor HPLC :

1.      Absorbsi UV maksimum sensitifitasnya 2 x 10^-16

2.      Absorbsi IR maksimum sensitifitasnya 10^-6

3.      Flourometri maksimum sensitifitasnya 10^-11

4.      Indek Bias maksimum sensitifitasnya 1 x 10^-7

5.      Konduktometri maksimum sensitifitasnya 10^-8

6.      Spektrometri Massa maksimum sensitifitasnya 10^-10

7.      Elektrokimia maksium sensitifitasnya 10^-12